類(lèi)器官代謝分析儀：微生理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)Transwell上的三維小腸模型

Tissue-on-a-Chip: Microphysiometry With Human 3D Models on Transwell Inserts

微生理測(cè)量已被證明是用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞能量代謝以及細(xì)胞間相互作用的有利工具，該技術(shù)之前主要用于監(jiān)測(cè)二維細(xì)胞層。最近，我們的研究小組發(fā)現(xiàn)，微生理測(cè)量也可以自動(dòng)檢測(cè)皮膚3D培養(yǎng)物的胞外酸化速率和跨上皮電阻值(TEER)，該培養(yǎng)物是培養(yǎng)在3D打印的封閉的生物芯片之中來(lái)維持氣液界面(ALI)。在這項(xiàng)工作中，我們提出了一種優(yōu)化的多通道芯片用于監(jiān)測(cè)商品化的3D小腸組織模型的TEER。實(shí)驗(yàn)持續(xù)1天，60分鐘為重復(fù)周期，每個(gè)周期包括三個(gè)階段：(1)維護(hù)氣液界面(ALI)；(2)加入測(cè)量培養(yǎng)基或者試驗(yàn)物；(3)清洗。初始平衡8小時(shí)后，加入細(xì)胞毒性和屏障破壞的化學(xué)物質(zhì)（0.2%十二烷基硫酸鈉），導(dǎo)致TEER隨時(shí)間變化逐步降低，而以前傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性測(cè)量方法是無(wú)法監(jiān)測(cè)到這種變化的。這項(xiàng)工作證實(shí)了使用自動(dòng)氣液界面(ALI)的多通道實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)三維腸模型的TEER的可行性。培養(yǎng)的人體組織結(jié)合智能移動(dòng)檢測(cè)技術(shù)，為在體外診斷提供了一個(gè)非常有前景的研究工具，特別是在毒理學(xué)，細(xì)胞代謝研究，藥物吸收等研究領(lǐng)域。

Keywords: microphysiometry, transepithelial electrical resistance, label-free monitoring, intestinal model, automated air–liquid interface

INTRODUCTION

盡管在藥物開(kāi)發(fā)的臨床前階段進(jìn)行了完整的試驗(yàn)，但未發(fā)現(xiàn)的毒性依然是臨床階段失敗的一個(gè)常見(jiàn)原因（Kola and Landis, 2004; Marx et al., 2016）。藥物毒性的研究之中，重要的一點(diǎn)就是要考慮小腸的吸收效應(yīng)。臨床前體內(nèi)評(píng)估通常依靠小鼠或大鼠模型來(lái)代表人類(lèi)特征（Le Ferrec et al.， 2001）。然而，嚙齒動(dòng)物模型不能可靠地預(yù)測(cè)藥物對(duì)于人體的各個(gè)方面的效應(yīng)，所以就可能出現(xiàn)對(duì)藥物毒性或再吸收的錯(cuò)誤評(píng)估。因此，近年來(lái)的研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到改善體外毒性研究。

在體外研究可重復(fù)性和分離影響變量的能力（Ferrick et al., 2008），有助于更好地理解毒性機(jī)制。但是2D細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系（Leonard et al., 2010; Ayehunie et al., 2018）有限的生理相關(guān)性和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中缺乏全自動(dòng)分析的問(wèn)題已經(jīng)在之前的文獻(xiàn)中討論過(guò)（Gómez-Sj?berg et al., 2007; Meyvantsson et al., 2008; Li et al.,2013）。 3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的最新進(jìn)展解決了這些局限性，并提供了新的模型來(lái)增強(qiáng)對(duì)新藥安全性和有效性的信心（Fang and Eglen, 2017; Park et al., 2018）。采用“組織芯片”方法，通過(guò)體外培養(yǎng)的組織和器官模型，來(lái)改進(jìn)對(duì)吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的評(píng)估（Madden et al., 2018）。

從結(jié)腸（大腸）癌中提取的Caco-2單層細(xì)胞是一種廣泛應(yīng)用于體外藥物吸收和毒性評(píng)估的細(xì)胞系，它可以代表三個(gè)吸收途徑：跨細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)途徑）、細(xì)胞間（細(xì)胞外途徑）和載體轉(zhuǎn)運(yùn)。但是，細(xì)胞系和小腸組織的相關(guān)性有限。文獻(xiàn)中（Shah et al., 2006）已經(jīng)描述，它只能預(yù)測(cè)跨細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)途徑）滲透。此外，貼壁培養(yǎng)的單層Caco-2培細(xì)胞缺乏細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，不能模擬人小腸的多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)。為了克服這種生理相關(guān)性的不足，科學(xué)家開(kāi)發(fā)了新的三維重建人體組織模型（Li et al., 2013; Ayehunie et al., 2018）。在空氣-液體界面（ALI）上培養(yǎng)三維小腸器官模型，彌補(bǔ)了體外培養(yǎng)的2D的形態(tài)學(xué)缺陷（Nossol et al.，2011）。

使用體外組織培養(yǎng)進(jìn)行藥物效應(yīng)分析的常用方法需要很多重復(fù)的組織樣本，還有繁瑣復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟。方法和測(cè)量的復(fù)雜性導(dǎo)致需要大量的人工以及細(xì)胞或組織相關(guān)的硬件設(shè)備，而這些又有可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，增加結(jié)果的誤判（Blume et al.， 2010）。

相對(duì)手動(dòng)測(cè)試，實(shí)時(shí)自動(dòng)分析細(xì)胞存活率是一種更優(yōu)化的測(cè)量吸收和毒性的方案。此外，有了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)，就可進(jìn)行短期和長(zhǎng)期的分析。對(duì)于長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)，自動(dòng)化設(shè)備取代人工更換培養(yǎng)基和添加試劑，以提高實(shí)驗(yàn)的通量和重復(fù)性（Kempner and Felder, 2002）?？傊?，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)測(cè)量可以同時(shí)觀察到多個(gè)細(xì)胞代謝參數(shù)，并且支持ALI培養(yǎng)的自動(dòng)化微流控系統(tǒng)。我們?cè)谠撗芯恐刑岢隽诉@樣的一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)：組織芯片（tissue-on-a-chip）結(jié)合ALI培養(yǎng)細(xì)胞（圖1）。通過(guò)生物芯片以及3D打印封閉的培養(yǎng)腔體成功培養(yǎng)了3D重建人類(lèi)小腸模型。

   在這項(xiàng)工作中，我們提出了一個(gè)三通道、全自動(dòng)的組織芯片測(cè)量系統(tǒng)（IMOLA-IVD，德國(guó)cellasys），該系統(tǒng)可以測(cè)量跨上皮細(xì)胞電阻（TEER），進(jìn)一步深入了解上皮細(xì)胞層的組織形態(tài)和屏障特性。值得注意的是，與之前描述的單通道芯片系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)在三個(gè)通道中都有一個(gè)自動(dòng)的ALI，使用的細(xì)胞培養(yǎng)基更少（Alexander et al., 2018）。因此，現(xiàn)可以一次在三個(gè)的芯片上進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，例如：測(cè)試物，對(duì)照和空白。

MATERIALS AND METHODS

Human 3D Tissue Model

實(shí)驗(yàn)采用重建的三維腸組織—EpiIntestinal-FT。這個(gè)基于人體細(xì)胞的3D組織整合了腸上皮細(xì)胞、Paneth細(xì)胞、M細(xì)胞、簇細(xì)胞和小腸干細(xì)胞以及人小腸成纖維細(xì)胞，它被培養(yǎng)在ALI模擬生理?xiàng)l件之中。EpiIntestinal-FT模型可以用來(lái)表征小腸功能的不同方面，包括屏障功能、代謝、炎癥和毒性反應(yīng)（Ayehunie et al ., 2018）。

Microphysiometric System

德國(guó)cellasys公司的IMOLA-IVD是一個(gè)由自動(dòng)化微流控系統(tǒng)擴(kuò)展的微生理測(cè)量系統(tǒng)（Brischwein和Wiest, 2019）。該設(shè)備的詳細(xì)設(shè)置在之前的報(bào)告中有描述（Weiss et al.， 2013）。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是生物芯片上裝有兩個(gè)交叉電極結(jié)構(gòu)的電阻傳感器、兩個(gè)電化學(xué)的pH傳感器、一個(gè)電流的測(cè)氧傳感器和一個(gè)溫度傳感器。來(lái)自傳感器的測(cè)量數(shù)據(jù)被數(shù)字化記錄并傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上的專(zhuān)有軟件—Data Acquisition and Link Application（DALiA）軟件。該軟件負(fù)責(zé)流體的數(shù)據(jù)的處理和流路的控制，使用一個(gè)定制化的開(kāi)/關(guān)協(xié)議，以控制蠕動(dòng)泵和微流控系統(tǒng)（雙向交界處的閥門(mén)）。使用這些工具可以并行監(jiān)控6通道IMOLA-IVDs同時(shí)獲得實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，例如測(cè)試物和陰性/陽(yáng)性對(duì)照通道。

為了更好地使用和維護(hù)IMOLA-IVD和ALI，Alexander et al（2018）開(kāi)發(fā)了一種新的封閉的培養(yǎng)腔設(shè)計(jì)，用Ultimaker 3D打印機(jī)打印的聚交酯并粘在生物芯片上。有了這種封閉的培養(yǎng)腔，就可以產(chǎn)生兩條不同的微流道：一條在培養(yǎng)腔頂端，一條是培養(yǎng)腔側(cè)面。通過(guò)一根頂端金電極和一根側(cè)面金電極傳感器可以測(cè)量在Transwell半透膜小室上培養(yǎng)的三維組織的TEER。

測(cè)量TEER的頻率為10kHz，外加電壓為30mv。結(jié)合密封腔的生物芯片和用于根尖線的射流頭如圖1所示。結(jié)合封裝的生物芯片和流路通道，如圖1所示。完整的設(shè)置如圖2所示。IMOLA suppo系rt 統(tǒng)(ISS-3)包括為IMOLA系統(tǒng)、用于控制流路系統(tǒng)的閥門(mén)的開(kāi)關(guān)，以及用于記錄氣泡探測(cè)器數(shù)據(jù)的電子設(shè)備等提供電源。

DALiA客戶端軟件應(yīng)用程序用于控制測(cè)量和記錄的數(shù)據(jù)。泵、流路模塊和細(xì)胞培養(yǎng)液等IMOLA系統(tǒng)都被安裝在通用的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)都在37?C。三個(gè)通道中的每一個(gè)都有兩條流路，一條是頂端，一條是側(cè)面，如圖3所示。兩種流路都可用于將多種物質(zhì)注射到細(xì)胞環(huán)境之中，如培養(yǎng)基和測(cè)試物。在這篇文章中，頂端流路可以引入兩種不同的物質(zhì)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和測(cè)試物。在TEER測(cè)量過(guò)程中，在培養(yǎng)的組織的頂端加入LBM低緩沖培養(yǎng)基，從而在頂端和基底側(cè)面（液體界面）之間建立一個(gè)導(dǎo)電連接。另外，頂端覆蓋了一層薄薄的培養(yǎng)基（空氣界面）（200nm）。基底側(cè)面流路定期向培養(yǎng)的組織的基底外側(cè)注入新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在本研究中，流路系統(tǒng)的連接如圖3所示。1號(hào)閥用于更換頂端培養(yǎng)基；2號(hào)閥負(fù)責(zé)插入的培養(yǎng)小室的頂端的填充或排空；3和4號(hào)閥門(mén)分別將頂端和基底側(cè)面的培養(yǎng)基注入到生物芯片或廢液瓶中，5和6號(hào)閥門(mén)交替切換到過(guò)濾的空氣。一個(gè)IMOLA-IVD使用6個(gè)閥門(mén)和單向模式控制的4個(gè)泵通道。這里展示的裝置使用三個(gè)IMOLA-IVD模塊平行地研究三個(gè)培養(yǎng)小室（三個(gè)生物芯片，每個(gè)都有一個(gè)頂端和一個(gè)基底側(cè)面）。

Assay Preparation for Verification

為驗(yàn)證流路系統(tǒng)的設(shè)置和測(cè)量，可以用磷酸緩沖液（PBS）做預(yù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于頂端和基底側(cè)面，使用滲透壓為300±10% mOsmol/kg的PBS溶液，通過(guò)頂端通道的試驗(yàn)物質(zhì)為1000±10% mOsmol/kg的PBS溶液。

Assay Preparation for the EpiIntestinalTM Model

開(kāi)始前，先將組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以穩(wěn)定狀態(tài)。然后注入5 ml 基底側(cè)面培養(yǎng)基 SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)；頂端加入200 μl 的SMI-100-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories) ；然后在 37?C和5% CO2培養(yǎng)箱至少培養(yǎng)24 小時(shí)。實(shí)驗(yàn)前，對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌和培養(yǎng)液預(yù)灌流。所有管道和頂端通過(guò)2.5%的次氯酸（Sigma Aldrich, #71696, diluted with double-distilled H2O）消毒20分鐘進(jìn)行滅菌處理，生物芯片密封腔是通過(guò)浸潤(rùn)在70%乙醇20分鐘進(jìn)行滅菌處理。隨后，基底側(cè)面和頂端注入培養(yǎng)基，對(duì)管道進(jìn)行預(yù)灌流處理。將整個(gè)系統(tǒng)和培養(yǎng)基放置在37?C和5% CO2培養(yǎng)箱之中過(guò)夜。最后，將含有小腸組織的培養(yǎng)小室放置在經(jīng)滅菌處理的生物芯片上。基底側(cè)面流路使用

SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)。頂端流路使用無(wú)緩沖DMEM (cellasys GmbH, Kronburg, Germany: SOP-G200-006; see supplement material) 和溶解在 DMEM之中的測(cè)試物。

最后使用濃度為0.2或2.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS)作為破壞3D小腸組織屏障的物質(zhì)。在預(yù)先設(shè)定的灌流周期內(nèi)，確定了兩個(gè)流體通道的時(shí)間順序。TEER測(cè)量周期包括：35分鐘ALI，10分鐘TEER測(cè)量和15分鐘的清洗周期。第一個(gè)ALI周期用于流體系統(tǒng)的內(nèi)部預(yù)灌流，將程序設(shè)定為每個(gè)循環(huán)為1小時(shí)，持續(xù)灌流24小時(shí)。第8小時(shí)，將頂端培養(yǎng)基更換為含0.2% SDS的培養(yǎng)基，循環(huán)一個(gè)周期，然后更換為不含SDS的培養(yǎng)基。

RESULTS

Verification of the Measurement Procedure and the Fluidic System

每個(gè)TEER測(cè)量周期由測(cè)量階段和沖洗階段，循環(huán)程序的一致性可以確保整個(gè)監(jiān)測(cè)期間的變化肯定是由待測(cè)物引起的。每次TEER測(cè)量開(kāi)始時(shí)，培養(yǎng)小室的頂端為空的，慢慢填充相應(yīng)的培養(yǎng)基。一旦達(dá)到足夠體積，TEER電極被浸沒(méi)在相應(yīng)的培養(yǎng)基之中，并開(kāi)始?jí)驕y(cè)量電阻。使用PBS溶液進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證的方法如圖4。TEER的振幅的最終標(biāo)準(zhǔn)值是244Ω。隨后加入測(cè)試物，電導(dǎo)率與PBS相比有所增高，電阻的振幅的準(zhǔn)值下降到132Ω。重新注入PBS后稀釋待測(cè)物，再吸出。如果沒(méi)有第二次注入PBS，測(cè)試物將一直保留在培養(yǎng)環(huán)境之中，持續(xù)影響細(xì)胞。如圖4所示，需要兩次清洗的循環(huán)才能除去測(cè)試物。結(jié)果表明，IMOLA-IVD裝置的灌流系統(tǒng)和傳感器的在整個(gè)測(cè)量過(guò)程之中工作正常。因此可得出結(jié)論，傳感器是精確穩(wěn)定的，振幅變化對(duì)應(yīng)于注入的PBS滲透壓的變化。

Control Experiments

為了驗(yàn)證該設(shè)置，在一個(gè)IMOLA上設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有正負(fù)對(duì)照的測(cè)試實(shí)驗(yàn)。在不添加任何物質(zhì)的情況下監(jiān)測(cè)小腸組織的TEER值20小時(shí)（陰性對(duì)照），然后在2.0%SDS的影響下監(jiān)測(cè)20-28小時(shí)（陽(yáng)性對(duì)照）。TEER測(cè)量每小時(shí)進(jìn)行一次。在每個(gè)測(cè)量周期中，TEER值可以用

PBS測(cè)量后期的平臺(tái)期的平均值來(lái)表示，如圖4所示。這些平臺(tái)期的平均值被整合成一個(gè)連續(xù)的TEER數(shù)據(jù)圖。圖5顯示了TEER值的大小和相位（左）以及實(shí)部和虛部（右）。

TEER值通常只顯示大小,但是，為了顯示所有的測(cè)量值，測(cè)量的阻抗在兩種常用坐標(biāo)系中充分顯示，即在極坐標(biāo)下（左）表示大小和相位，在笛卡爾坐標(biāo)下（右）表示實(shí)部和虛部。其數(shù)學(xué)表達(dá)式如公式1所示：

Tissue-on-a-Chip Model

Figure 6 加入0.2% SDS 的腸組織模型。經(jīng)過(guò)開(kāi)始的5小時(shí)，TEER達(dá)到270Ω的平均值。第8小時(shí)加入測(cè)試物SDS，TEER迅速上升，隨后線性降低，在第18小時(shí)降到到225Ω。需要注意的是，SDS不會(huì)改變細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓濃度。測(cè)定的0、0.2和2.0% SDS的培養(yǎng)基的滲透壓濃度 (OSMOMAT 030, Gonotec, Berlin, Germany) 基本一致(300±5% mOsmol/kg)。

CONCLUSION

在這里，我們提出了原理證明實(shí)驗(yàn)使用三通道微生理測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量重建腸上皮模型的TEER與ALI。參數(shù)的測(cè)量是非侵入性的、實(shí)時(shí)的，并且系統(tǒng)定期自動(dòng)更新培養(yǎng)基。在TEER測(cè)量中，培養(yǎng)小室的頂部也注入培養(yǎng)基。PBS和2.0% SDS的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了該測(cè)量方法和系統(tǒng)。

8 h后加入測(cè)試物（0.2% SDS）后發(fā)現(xiàn)TEER呈下降趨勢(shì)。在未來(lái)的工作中，我們建議進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，使用測(cè)試物和微傳感器來(lái)獲取pH值和溶解氧的數(shù)據(jù)(Wiest et al.，2016)。

總的來(lái)說(shuō)，IMOLA-IVD系統(tǒng)已被證明是一種靈靈活、可定制的系統(tǒng)，用于分析各種細(xì)胞培養(yǎng)物模型，包括貼壁的2D細(xì)胞系，3D球狀體，以及用于重構(gòu)人類(lèi)表皮和腸的組織/類(lèi)器官芯片。未來(lái)的工作將包括研究和優(yōu)化灌流循環(huán)(例如，增加測(cè)試物質(zhì)之前的穩(wěn)定期的時(shí)間)和電極幾何形狀，以及光譜測(cè)量信息的收集（Gilbert et al., 2019; van der Helm et al., 2019），以建立一種可用于肺或其他粘液細(xì)胞模型的多功能的組織芯片的研究工具。

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The datasets generated for this study are available on request to the corresponding author.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

All authors listed have made a substantial, direct and intellectual contribution to the work, and approved it for publication