應(yīng)用案例（蛋白穩(wěn)定性分析儀-PSA-16）：PSA用于開發(fā)新型疫苗

蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16助力武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研工作者于2024年8月份在Nature子刊《npj Vaccines》雜志上發(fā)表論文“An attachment glycoprotein nanoparticle elicits broadlyneutralizing antibodies and protects againstlethal Nipah virus infection"。本研究以尼帕病毒G蛋白頭部域?yàn)榭乖袠?biāo)，成功開發(fā)出一種新型的、安全有效的自組裝蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗能夠誘導(dǎo)抑制多種亨尼帕病毒感染的廣譜中和抗體，并對(duì)尼帕病毒感染的倉鼠提供保護(hù)。

Zhou, D. et al. 

npj Vaccines 9, 158 (2024).

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)多肽鏈在溫度影響下的形變能力，主要體現(xiàn)在溫度改變時(shí)多肽鏈的化學(xué)特性和空間構(gòu)象的變化，變化越小熱穩(wěn)定性越高。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性受到不同溫度、pH值、離子強(qiáng)度等外界因素的影響，在生物技術(shù)、藥物研發(fā)以及食品工業(yè)等領(lǐng)域，具有重要意義。

蛋白質(zhì)變性溫度是生物學(xué)家們研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要的概念，是指蛋白質(zhì)在特定溫度條件下受到熱力作用時(shí)，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的溫度點(diǎn)，一般溫度較高時(shí)，蛋白質(zhì)從穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)變化成松散的無序結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一般使用熱變性中點(diǎn)溫度（Tm）來表示，即蛋白質(zhì)解折疊50% 時(shí)的溫度。

01 前言

尼帕病毒（NiV）是一種負(fù)義單鏈RNA病毒，ZUI初是在1998年至1999年馬來西亞和新加坡爆發(fā)期間分離和鑒定的。NiV感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦炎和呼吸道疾病，病死率高達(dá)75%。另外在幸存者中也觀察到長期神經(jīng)系統(tǒng)疾病和NiV感染復(fù)發(fā)。目前，還沒有批準(zhǔn)的可用于人類的疫苗或治療方法。NiV編碼一種病毒膜蛋白：糖蛋白（G），G蛋白位于病毒表面，負(fù)責(zé)受體識(shí)別和結(jié)合，受體結(jié)合后，G蛋白經(jīng)歷一系列構(gòu)象變化，完成與靶細(xì)胞的膜融合，從而幫助病毒進(jìn)入靶細(xì)胞并引發(fā)感染。此外，許多中和和保護(hù)性抗體主要針對(duì)G蛋白，表明G病毒蛋白是疫苗開發(fā)的關(guān)鍵抗原。最近已經(jīng)開發(fā)了多種針對(duì)NiV感染的疫苗平臺(tái)，包括亞基疫苗、mRNAs、病毒樣顆粒（VLP）、病毒載體疫苗和DNA疫苗，但還沒有對(duì)自組裝納米粒子平臺(tái)進(jìn)行NiV感染評(píng)估。

02 摘要

作者設(shè)計(jì)了一種基于鐵蛋白的自組裝納米粒子，在表面顯示NiV G頭部結(jié)構(gòu)域（NiV G-鐵蛋白，NiV G-ferritin），并評(píng)估了可溶性NiV G頭結(jié)構(gòu)域（NiV sG）或NiV G-鐵蛋白引發(fā)的免疫反應(yīng)，并且通過一系列研究數(shù)據(jù)表明NiV G鐵蛋白是一種安全有效的尼帕病毒感染候選疫苗。

03 結(jié)果

作者借助北京佰司特科技有限責(zé)任公司自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理進(jìn)行NiV G-ferritin和NiV sG的熱穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表現(xiàn)出相似的熱穩(wěn)定性，Tm為~65°C，表明NiV G和ferritin的融合對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性沒有顯著影響。

04 方法

蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16（北京佰司特科技有限責(zé)任公司）通過差示掃描熒光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）測(cè)定靶蛋白的熱穩(wěn)定性。將樣品稀釋至0.5mg/mL，并將20μL稀釋后的樣品裝入石英玻璃管中。

使用23至97°C的線性溫度掃描，以1°C/min的加熱速度實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測(cè)量靶蛋白在280nm紫外激發(fā)下的330nm和350nm的熒光強(qiáng)度（F）。

根據(jù)F350nm/F330nm曲線的斜率計(jì)算熱變性中點(diǎn)溫度（thermal transition midpoint，Tm）。每個(gè)樣品平行測(cè)量四次。

作者也致謝了北京佰司特科技有限責(zé)任公司，提供自主研發(fā)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16，獲得蛋白樣品熱穩(wěn)定性分析的數(shù)據(jù)。

05 內(nèi)源差示掃描熒光法（inDSF）

內(nèi)源差式掃描熒光inDSF，基于蛋白質(zhì)中特定氨基酸的熒光特性。這些氨基酸的熒光強(qiáng)度與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，因此，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，這些氨基酸的熒光信號(hào)也會(huì)隨之改變。不需要額外的熒光染料加入到檢測(cè)體系中，利用蛋白內(nèi)部芳香族氨基酸的自發(fā)光原理。不需要任何額外的標(biāo)記或固定步驟，避免引入結(jié)果的不確定性。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子中芳香環(huán)氨基酸在處于不同極性的微環(huán)境時(shí) (如疏水或親水環(huán)境中)，其被激發(fā)的內(nèi)源熒光的最大發(fā)射光譜會(huì)發(fā)生位移。蛋白質(zhì)中內(nèi)源熒光主要來自含芳香環(huán)氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸內(nèi)源熒光ZUI強(qiáng)。當(dāng)它在蛋白內(nèi)部時(shí)，發(fā)射光主要在330波段，當(dāng)?shù)鞍滓坏┤フ郫B，暴露在溶劑中，發(fā)出的光就會(huì)從330波長紅移到350。所以通過280激發(fā)，檢測(cè)330/350的比值變化，就能測(cè)量蛋白質(zhì)的Tm值。

以色氨酸為例，在蛋白質(zhì)疏水的內(nèi)核微環(huán)境中，其內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長在330 nm左右，而在親水的極性微環(huán)境中，色氨酸的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長則出現(xiàn)在350 nm左右。蛋白質(zhì)熱變性或者化學(xué)變性通常會(huì)導(dǎo)致色氨酸殘基周圍微環(huán)境的極性發(fā)生變化，使通常被包埋于蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核的色氨酸逐漸暴露于親水的環(huán)境中，從而導(dǎo)致發(fā)射內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長發(fā)生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區(qū)域 移動(dòng)。

特點(diǎn)：內(nèi)源差式掃描熒光DSF無需復(fù)雜的樣品處理或標(biāo)記步驟，實(shí)驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)便。但不是所有蛋白質(zhì)都含有足夠的熒光基團(tuán)，且可能會(huì)受其他基團(tuán)影響。

06 蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16

北京佰司特科技有限責(zé)任公司于2023年推出了自主研發(fā)的第一款國產(chǎn)的蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16。

PSA-16的性能和參數(shù)達(dá)到進(jìn)口設(shè)備的水平，價(jià)格卻遠(yuǎn)低于進(jìn)口產(chǎn)品，彌補(bǔ)了目前國產(chǎn)自主設(shè)備在蛋白穩(wěn)定性研究分析領(lǐng)域的空白。

主要參數(shù)★ 測(cè)定參數(shù)：Tm、Cm、ΔG等；

★ 樣品通量：16個(gè)；

★ 樣品體積：≤20 uL；

★ 濃度范圍：0.01-200 mg/ml；

★ 溫控范圍：15-110度；

★ 變溫速度：0.1-15度/分鐘；

★ Tm重復(fù)性：CV小于1%；

★ 耗材參數(shù)：一次性，無需清洗；

★ 八聯(lián)排設(shè)計(jì)，適配多通道移液器；

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16基于內(nèi)源差示掃描熒光（ifDSF）技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究、蛋白質(zhì)類大分子藥物（抗體）優(yōu)化工程、蛋白質(zhì)類疾病靶點(diǎn)的藥物小分子篩選和結(jié)合力測(cè)定等領(lǐng)域，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)中色氨酸/酪氨酸的熒光性質(zhì)與它們所處的環(huán)境息息相關(guān)，因此可以通過檢測(cè)蛋白內(nèi)部色氨酸/酪氨酸在加熱或者添加變性劑過程中的熒光變化，測(cè)定蛋白質(zhì)的化學(xué)和熱穩(wěn)定性。

PSA-16采用紫外雙波長檢測(cè)技術(shù)，可精準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)去折疊過程中色氨酸和酪氨酸熒光的變化，獲得蛋白的Tm值和Cm值等數(shù)據(jù)；測(cè)定時(shí)無需額外添加染料，不受緩沖液條件的限制且測(cè)試的蛋白質(zhì)樣品濃度范圍非常廣（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可廣泛用于去垢劑環(huán)境中的膜蛋白和高濃度抗體制劑的穩(wěn)定性研究。此外，PSA-16具有非常高的數(shù)據(jù)采集速度，從而可提供超高分辨率的數(shù)據(jù)。同時(shí)PSA-16一次最多可同時(shí)測(cè)定16個(gè)樣品，通量高；每個(gè)樣品僅需要15 uL，樣品用量少，非常適合進(jìn)行高通量篩選。PSA-16操作簡(jiǎn)單，使用后無需清洗，幾乎無維護(hù)成本。

多功能蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16應(yīng)用涵蓋植物、生物學(xué)、動(dòng)物科學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、工業(yè)發(fā)酵、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)、蛋白質(zhì)工程等多學(xué)科領(lǐng)域。蛋白質(zhì)是最終決定功能的生物分子，其參與和影響著整個(gè)生命活動(dòng)過程?，F(xiàn)代分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、動(dòng)醫(yī)動(dòng)科、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)等多種學(xué)科研究的很多方向都涉及蛋白質(zhì)功能研究，以及其下游的各種生物物理、生物化學(xué)方法分析，提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)樣品是所有蛋白質(zhì)研究的先決條件。因此多功能蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析系統(tǒng)在各學(xué)科的研究中都有基礎(chǔ)性意義。

1.    抗體或疫苗制劑、酶制劑的高通量篩選

2.    抗體或疫苗、酶制劑的化學(xué)穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性評(píng)估、等溫穩(wěn)定性研究等

3.    生物仿制藥相似性研究（Biosimilar Evaluation）

4.    抗體偶聯(lián)藥物（ADC）研究

5.    多結(jié)構(gòu)域去折疊特性研究

6.    物理和化學(xué)條件強(qiáng)制降解研究

7.    蛋白質(zhì)變復(fù)性研究（復(fù)性能力、復(fù)性動(dòng)力學(xué)等）

8.    膜蛋白去垢劑篩選，膜蛋白結(jié)合配體篩選（Thermal Shift Assay）

9.    基于靶標(biāo)的高通量小分子藥物篩選（Thermal Shift Assay）

10.    蛋白純化條件快速優(yōu)化等